Una técnica molecular de uno o dos pasos que primero convierte plantillas de ARN en ADN complementario (ADNc) mediante una transcriptasa reversa y luego amplifica dianas cDNA específicas por PCR para detectar o analizar secuencias de ARN.

Principio

La transcripción inversa produce una copia de ADN del ARN, lo que permite que las polimerasas dirigidas por ADN amplifiquen secuencias que estaban en forma de ARN; combinar RT con PCR une la sensibilidad de la amplificación al contenido informativo del ARN (expresión, genomas virales).

Demostración

Detección de ARN viral en una muestra de paciente: la transcripción inversa convierte el ARN genómico viral en cDNA, que luego se amplifica por PCR con cebadores específicos del virus para generar una señal diagnóstica.

Aplicación incorrecta

Equiparar la detección por RT-PCR con infectividad presente o expresión activa sin controles temporales o de viabilidad; usar cebado de transcripción inversa ineficiente que sesga la representación de transcritos y distorsiona la interpretación comparativa.

Consecuencia

Permite la detección y análisis sensibles de especies de ARN (ARNm, genomas virales, ARN no codificante), posibilitando estudios de expresión génica, diagnósticos de patógenos y ensayos específicos de transcritos cuando se consideran la eficiencia de la transcripción inversa y los controles.

Inversión

Si se omite o es ineficiente la transcripción inversa, las dianas ARN no pueden ser amplificadas de forma estable por las polimerasas de ADN y permanecerán indetectables por PCR; por el contrario, los métodos de amplificación directa de ARN difieren en química y limitaciones.

Límite

Cubre ensayos que usan transcriptasa inversa para generar cDNA seguido de amplificación por PCR; excluye ensayos solo de ADN, tecnologías de amplificación directa de ARN que no producen cDNA y la detección de ARN basada en hibridación sin copia enzimática.

Tensión semántica

Tensión entre usar RT-PCR como medida semicuantitativa de expresión frente a un test puramente cualitativo de presencia/ausencia; también compite con enfoques digitales o basados en secuenciación para cuantificar ARN.

Síntesis

La RT-PCR enlaza las moléculas de ARN con la amplificación basada en ADN convirtiendo ARN en cDNA y luego amplificando dianas definidas, combinando especificidad a nivel de transcrito con la sensibilidad de la PCR para diagnóstico y análisis de expresión.