Un método basado en láser que analiza propiedades físicas (dispersión frontal y lateral) y fluorescentes de células o partículas individuales en suspensión cuando pasan una a una por un punto de interrogación, y que puede opcionalmente ordenar subpoblaciones desviando gotas cargadas (FACS).

Principio

El enfoque hidrodinámico coloca partículas individuales a través de haces láser; detectores miden dispersión de luz y fluorescencia de marcadores etiquetados; las señales digitales se usan para aplicar puertas (gating) y definir poblaciones, y el ordenamiento carga gotas y las desvía electrostáticamente para recoger subconjuntos.

Demostración

Marcar células mononucleares de sangre periférica con anticuerpos conjugados a fluoróforos contra CD3, CD4 y CD8, seleccionar linfocitos por dispersión, cuantificar frecuencias CD4+ y CD8+ e aislar células CD4+ por FACS para cultivo posterior.

Aplicación incorrecta

No compensar la superposición espectral, lo que provoca falsos positivos; aplicar gates inadecuados sin controles; sobreinterpretar eventos muy raros sin adquirir suficientes eventos o enriquecimiento; analizar células muertas o de mala calidad sin excluir la viabilidad.

Consecuencia

Proporciona fenotipado multiparamétrico y recuento celular de alto rendimiento, y—cuando se usa el ordenamiento—permite aislar subpoblaciones vivas para ensayos funcionales o perfilado molecular posterior.

Inversión

La microscopía conserva el contexto espacial y morfológico y puede mostrar localización subcelular, pero tiene menor rendimiento y es menos cuantitativa para grandes números de células.

Límite

Requiere una suspensión de células individuales y diferencias detectables por fluorocromos o dispersión; excluye el contexto tisular a menos que se disocie; limitada por la disponibilidad de fluorocromos, la sensibilidad del detector, la superposición espectral y la viabilidad de la muestra.

Tensión semántica

Tensión entre citometría analítica (solo medida) y FACS (capacidad de ordenamiento), y entre paneles de alto número de parámetros que aumentan la información y la complejidad de la compensación y el análisis de datos.

Síntesis

La citometría de flujo es una técnica en suspensión unicelular que utiliza dispersión de luz y fluorescencia para fenotipar y cuantificar células rápidamente y, si está equipada para ordenar, para aislar físicamente poblaciones definidas; sacrifica la arquitectura tisular por velocidad y multiplexación y exige diseño de panel y controles cuidadosos.