Un enfoque basado en PCR que monitoriza la acumulación de ADN amplificado en tiempo real, normalmente mediante reporteros fluorescentes, para inferir la cantidad inicial de nucleico diana en la muestra de forma relativa o absoluta.

Principio

Durante la amplificación exponencial, la señal del reportero (tinción intercalante o fluorescencia de sonda) es proporcional a la cantidad de producto; registrando umbrales de ciclo o modelando la cinética de amplificación se puede estimar la abundancia inicial del molde cuando se tienen en cuenta la eficiencia y los estándares.

Demostración

Medir la abundancia de un transcrito: cDNA retrotranscrito de dos condiciones se amplifica con un ensayo de sonda; la diferencia en los valores de umbral de ciclo (Ct), corregida por la eficiencia del ensayo y genes de referencia, estima el cambio relativo en la expresión.

Aplicación incorrecta

Usar diferencias de Ct sin validar la eficiencia del ensayo o la normalización, tratar el Ct como lineal con el número de copias fuera de la ventana exponencial, o comparar entre ensayos sin estándares comunes llevando a cuantificaciones engañosas.

Consecuencia

Permite la cuantificación sensible y de alto rendimiento de ácidos nucleicos para estudios de expresión, estimación de carga de patógenos y análisis de número de copias cuando se aplican calibración, controles y comprobaciones de eficiencia.

Inversión

Si la eficiencia de amplificación es desconocida o variable, o la fluorescencia no es lineal con el producto, la qPCR no puede cuantificar de forma fiable; la PCR cualitativa sin detección en tiempo real proporciona presencia/ausencia pero no cuantificación robusta.

Límite

Se refiere a la PCR monitorizada por fluorescencia en tiempo real para cuantificación; excluye inferencias semi-cuantitativas basadas en PCR de punto final, recuentos por secuenciación salvo que estén calibrados, y esquemas de detección no fluorescentes sin datos cinéticos.

Tensión semántica

Tensión entre cuantificación relativa y absoluta, y entre qPCR y PCR digital o cuantificación basada en secuenciación, que ofrecen diferentes compensaciones en precisión, rango dinámico y supuestos.

Síntesis

La PCR cuantitativa une la monitorización en tiempo real de la fluorescencia de amplificación con la interpretación cinética y la calibración para transformar la PCR de un ensayo de presencia/ausencia en una herramienta cuantitativa para medir ácidos nucleicos.