Une approche basée sur la PCR qui surveille en temps réel l'accumulation d'ADN amplifié, typiquement par des réporteurs fluorescents, pour déduire la quantité initiale de cible nucléique dans l'échantillon de façon relative ou absolue.

Principe

Pendant l'amplification exponentielle, le signal du réporteur (colorant intercalant ou fluorescence d'une sonde) est proportionnel à la quantité de produit ; en enregistrant le seuil de cycle ou en modélisant la cinétique d'amplification, l'abondance initiale du modèle peut être estimée si on tient compte de l'efficacité et des étalons.

Démonstration

Mesure de l'abondance d'un transcrit : l'ADNc rétrotranscrit de deux conditions est amplifié avec un test à sonde ; la différence de valeurs de seuil de cycle (Ct), corrigée pour l'efficacité du test et les gènes de référence, estime le changement d'expression relatif.

Mauvaise application

Utiliser des différences de Ct sans valider l'efficacité du test ou la normalisation, traiter Ct comme linéaire avec le nombre de copies en dehors de la phase exponentielle, ou comparer entre tests sans étalons communs conduisant à une quantification trompeuse.

Conséquence

Permet une quantification sensible et à haut débit des acides nucléiques pour des études d'expression, estimation de charge virale et analyses du nombre de copies quand calibration, contrôles et vérifications d'efficacité sont appliqués.

Inversion

Si l'efficacité d'amplification est inconnue ou variable, ou si la fluorescence n'est pas linéaire avec le produit, la qPCR ne peut pas quantifier de manière fiable ; la PCR en point final sans détection en temps réel donne présence/absence mais pas de quantification robuste.

Limite

Désigne la PCR surveillée en temps réel par fluorescence pour la quantification ; exclut les inférences semi-quantitatives basées sur PCR en point final, les décomptes basés sur séquençage sauf s'ils sont calibrés, et les méthodes de détection non fluorescentes dépourvues de données cinétiques.

Tension sémantique

Tension entre approches de quantification relative versus absolue, et entre qPCR et PCR numérique ou quantification par séquençage qui offrent différents compromis en précision, plage dynamique et hypothèses.

Synthèse

La PCR quantitative associe la surveillance en temps réel de la fluorescence d'amplification à l'interprétation cinétique et à la calibration pour transformer la PCR d'un test de présence/absence en un outil quantitatif de mesure d'acides nucléiques.